固相多肽合成 (SPPS)：一条研究多肽是如何被组装出来的

20 世纪 60 年代初之前，多肽合成在溶液中进行：每形成一个酰胺键都需要把中间体分离、纯化、表征，再进入下一步。一旦序列超过五到六个残基，产率快速衰减，流程对大多数实验室就难以执行。

1963 年，洛克菲勒大学的 Bruce Merrifield 在 Journal of the American Chemical Society 上发表了在不溶性树脂上合成四肽的工作。这个思路反直觉：把 C 端残基锚定到聚合物上，用大大过量的试剂把每一步偶联逼近完全，再通过过滤与冲洗把所有杂质带走。最初业界态度强烈怀疑，一位审稿人甚至称其为“闹剧，根本算不上化学”，但其可重复性与速度最终让它成为主流。Merrifield 于 1984 年获得诺贝尔化学奖。

如今，SPPS 几乎是所有研究规模多肽生产的基础——多肽激素类似物、蛋白片段、临床前工具化合物都依赖它。液相合成在超大规模工业生产中仍有空间，但在 2026 年的研究语境下，SPPS 是无可争议的默认方法。

每个氨基酸都同时带有氨基 (NH2) 和羧基 (COOH)。要按正确顺序连接它们，就必须暂时把进入的残基的 α-氨基保护起来，只让羧基反应。Fmoc 与 Boc 的差别在于使用何种保护基团，以及如何脱除。

Boc 策略是 Merrifield 最初采用的方案：α-氨基用叔丁氧羰基保护，每个循环用三氟乙酸 (TFA) 脱除；侧链通常用苄基类基团保护，最终从树脂上切割肽链需要使用无水氟化氢 (HF)，这是一种攻击性强的试剂，需要专门设备。

Fmoc 策略 (9-芴基甲氧羰基) 改变了这一切：α-氨基用温和的碱脱除——通常是 20% 哌啶的 DMF 溶液——只有最终切割使用 TFA。这种“碱不稳定 / 酸不稳定”的组合对色氨酸、甲硫氨酸等对酸敏感的残基很友好，也易于自动化。2026 年的研究多肽，Fmoc/tBu 是几乎所有学术与商业实验室的默认选择。

树脂并非惰性载体。连接肽链与聚合物的 linker（连接基团）决定了最终切割之后 C 端是什么官能团。需要游离酸 (–COOH) C 端的肽链通常构建在 Wang 树脂上，后者基于聚苯乙烯骨架与 4-羟基苄醇 linker。需要酰胺 (–CONH2) C 端的肽链——这是大量生物活性序列的常见结构——则使用 Rink amide 树脂。

两者都对酸不稳定，在最终步骤用 TFA 处理时释放肽链。Wang 与 Rink amide 之间的选择由目标序列决定，而不是操作偏好。其他 linker 如 2-氯三苯甲基允许在温和条件下切割，同时保留侧链保护，适合用于生成保护片段以便后续连接反应。

树脂的装载量（loading，以 mmol/g 计）直接影响合成规模与产率。高 loading 单位树脂出肽更多，但容易在合成中促进相邻链之间的聚集，对疏水序列或 β-片层倾向序列的偶联效率不利。许多课题组在合成困难序列时会选用较低 loading（0.2–0.4 mmol/g）。

酰胺键在室温下不会自发形成，羧基必须先被活化。现代偶联试剂会生成一个高反应性中间体——通常是 OBt 或 OAt 的活性酯——使其能与生长肽链末端的游离氨基快速反应，并在合理时间内逼近定量转化。

HBTU 与 HATU 分别是基于 HOBt 与 HOAt 的鎓盐型偶联试剂。HATU 偶联更快，且对 α-碳的外消旋化（epimerization）更少，这对组氨酸、半胱氨酸、N-甲基化氨基酸等问题残基尤其重要。HBTU 更便宜，对大部分常规序列已经够用。DIC（二异丙基碳二亚胺）与 HOBt 的组合仍是稳健的替代，尤其在连续流化学和长时间偶联场景下。

每个循环通常使用 3–5 当量的活化氨基酸，在室温下 30–60 分钟即可完成，或通过微波活化在数分钟内完成。对困难位置则采用双偶联（double coupling）。Kaiser 比色测试（基于茚三酮）能在加入下一个残基之前检测残余游离氨基，及时发现未完全偶联。

当序列在树脂上完整组装后，只剩最后一步：把肽链从载体上切下，同时去除全部侧链保护基。所用工具是基于 TFA 的混合液，通常为 85–95% TFA，余下成分是 scavenger（捕获剂），根据残基组成选用水、三异丙基硅烷 (TIS)、乙二硫醇 (EDT) 或苯酚。

Scavenger 不是可选项。脱保护过程中会产生碳正离子，它们若不被捕获，就会共价修饰 Trp、Tyr、Met、Cys 等敏感残基。常见的 Reagent K 配方包含 TFA/水/EDT/硫代茴香醚/苯酚；不含半胱氨酸的肽通常 TFA/TIS/水 95:2.5:2.5 就足够。

切割完成后，粗肽通常被沉淀到冷却的乙醚中，离心并多次洗涤，以去除 TFA、scavenger 与脱保护副产物。沉淀重新溶于水/乙腈或稀醋酸，经反相制备型 HPLC（高效液相色谱）纯化，常用 C18 柱、乙腈/水线性梯度，二者均含 0.1% TFA。20–30 个残基的肽经 SPPS 与纯化后，典型分离产率在 20–50% 之间，序列依赖性很强。每批样品在放行用于研究前需经分析型 HPLC 与质谱表征。

评估一条用于研究的多肽时，有三项指标最为重要。第一，分析型 HPLC 纯度：体外研究通常以 ≥98% 为合理基线，不少课题组对动物模型研究要求 ≥99%，以限制杂质带来的混淆变量。第二，质谱身份确认：观测的单同位素质量应在仪器误差范围内与理论值吻合。

第三，净肽含量。纯化后的肽通常以三氟乙酸盐形式存在，并会吸收水分。总重量并不等于活性肽重量。氨基酸定量分析 (AAA) 或基于 Trp、Tyr 等含发色团残基的紫外定量可以校正这一偏差。如果忽略这一步，细胞实验中的标称浓度可能被高估 20–30%。

2026 年，SPPS 仍在演进：连续流合成、微波活化，以及能在 Asp-Gly 与 Asp-Ser 序列中抑制天冬氨酰亚胺（aspartimide）形成的新型树脂与骨架保护。但 Merrifield 的核心逻辑——锚定、偶联、冲洗、重复——已经 60 余年没有改变。